一、背景介绍：

在2010版GMP的无菌药品附录中明确提到关于化学消毒灭菌的条款4条、辐射灭菌的条款1条、热力灭菌的条款7条，共计12条，对于无菌药品的生产中，防止微生物污染、内毒素污染一直是生产企业、监管机构关注的重点，灭菌不仅要实现杀灭或除去所有微生物繁殖体和芽孢，同时也必须保证制剂的稳定性及其临床效果，因此选择适宜的灭菌方法对保证产品质量具有重要意义。

灭菌方法可分为物理灭菌法和化学灭菌法，以下介绍洁净室内遇到的常用的消毒灭菌方法，对于除菌过滤这类除菌方法就不在这里进行介绍。

二、洁净室常用的消毒灭菌方法

1、 化学消毒灭菌法：

1）化学消毒剂的杀菌机制主要是以下几种：

A、促进菌体蛋白质变性或凝固

B、干扰细菌的酶系统和代谢

C、损伤菌细胞膜，降低细胞表面张力并增加其通透性，胞外液内渗，致使细菌破裂。

2）消毒剂的选择：消毒剂的杀菌效果会受到被消毒表面的类型、与被消毒表面的接触时间及微生物种群的影响，每个企业应根据各自环境控制的需求选择合适的消毒剂，同时应进行消毒验证以确定消毒效果。

一般选择原则：

A、消毒剂的固有特性，消毒表面与消毒剂的适用性。

B、产品的适应性，消毒对象的理化特性和使用价值；

C、人员的安全性，消毒剂的使用方法和使用频率；

D、环境中微生物的菌群，污染微生物的种类、数量和存在状态；

E、合格供应商及供应商评价。

3）消毒剂使用注意事项：

A、防止环境中的微生物因对同一种消毒剂产生抗性而影响实际消毒效果，故一般药企会挑选一种及以上的消毒剂进行定期轮换使用

B、有的消毒剂使用后有一定残留并会不断累积，故应注意选择残留小甚至无残留的消毒剂，若必须选择有残留的消毒剂则必须考虑残留消除的问题。

C、不得将非同种类的消毒剂联合或混合使用，否则可能会引发危险化学反应产生有毒化合物或产生拮抗作用使消毒剂消毒效果减弱甚至消失。

4）消毒剂验证

根据各自企业特点选择消毒剂后，应进行消毒剂验证确认消毒剂的消毒效力

A、 中和剂效力及毒性试验

B、 消毒剂硬面测试法/定量悬浮测试法（一般以下降各类型菌种的对数量作为标准）

C、 现场消毒效果确认（A和B均通过方可进行）

5）熏蒸（气体灭菌）

利用化学消毒剂形成的气体来杀灭微生物的措施，如甲醛、臭氧、环氧乙烷、过氧乙酸、过氧化氢等，甲醛的灭菌效果非常理想，但因对人体有致癌作用，故现在不提倡使用；环氧乙烷也是常用的灭菌剂，但因其有灭菌后有一定残留；现在常用过氧化氢和过氧乙酸的混合物或直接使用过氧乙酸或过氧化氢进行喷雾灭菌，灭菌后几乎无残留。

2、 辐射杀菌法：

分为非电离辐射和电离辐射杀菌法两种

1）非电离辐射：如日光、紫外线等

日常洁净室使用紫外灯管对于洁净室的微生物的负荷进行一定控制，但无法完全进行杀灭，如新的紫外灯杀灭葡萄球菌需60min，使用6个月后需90min，1年后需120min，紫外灯管的使用要保持清洁，表面有尘土会降低灭菌效果。且其消毒效果与紫外线强度、照射时间、温度和湿度等因素有关。

2）电离辐射：如高速电子束、X射线和γ射线

目前的辐射灭菌多采用钴60放射出的γ射线，具有能力高、穿透力高、穿透力强，无放射污染和残留量、冷灭菌、适用范围广泛等特点，辐射灭菌过程必须对辐射剂量进行监控，并确保其无菌保证水平SAL。

3、 热力灭菌法

利用高温杀灭微生物，强热能使蛋白质凝固而导致细胞死亡，热力灭菌法可分为湿热灭菌和干热灭菌。

1）湿热灭菌法

A、原理：水是一种可以使蛋白质、核酸及脂肪等大分子水解的重要生化反应剂。高温的水蒸气可活化细胞内的核酸酶，使之释放，造成核酸破坏，可破坏细胞膜的组成，使酶失活，并导致蛋白质凝固，从而使细胞死亡。

B、适用于药品、玻璃器械、培养基、无菌衣、敷料以及其他遇高温与湿热不发生变化或损坏的物质。

C、包括煮沸法、巴氏消毒法、间歇蒸汽灭菌法、流动蒸汽消毒法及高压蒸汽灭菌法等。

D、常用高压蒸汽灭菌法，高压蒸汽灭菌时，加热时蒸汽不外溢，容器内的蒸汽温度随蒸汽压力的增加而升高，杀菌能力也随之加强。

a、高压蒸汽灭菌有两种类型，一是下排气法、二是预真空法，

b、常用参数：Z值、灭菌时间FT、灭菌率、F0值、无菌保证水平（SAL）

c、验证：BD实验、气密性试验（真空状态下泄漏试验）、空载热分布、满载热分布和热穿透、微生物挑战性试验、呼吸器的评估。

2）干热灭菌

A、原理：利用高温使微生物或脱氧核糖核酸酶等生物高分子产生非特异性氧化而杀灭微生物的方法。

B、适用于耐高温物品的灭菌，如玻璃、金属设备、器具，不需湿气穿透的油脂类，耐高温的粉末化学药品等，但不适用于橡胶、塑料及大部分药品的灭菌，同时干热也用于去热原。

C、包括隧道式和干热灭菌烘箱，根据灭菌目的不同，可划分为灭菌工艺、除热原工艺；

D、验证：过滤器完整性测试、空载热分布、满载热分布和热穿透、微生物挑战性实验（根据灭菌工艺选择微生物及内毒素挑战指示剂）

3）在同样温度下，湿热灭菌比干热灭菌的效果好，主要原因有三种：

A、湿热时细菌细胞吸收水分，菌体蛋白较易凝固；

B、湿热的蒸汽存在潜热，水由气态变为液态时释放的潜热可迅速提高被灭菌物体的温度；

C、湿热的穿透能力强。

三、各灭菌方法的日常实验室监测手段简介

1、 化学消毒灭菌法：

1）消毒剂擦拭/浸润消毒：

A、监测A/B级消毒剂生物负载

B、使用表面微生物采样等方法对消毒后的日常洁净室表面进行采样监测

2）熏蒸（气体灭菌）

使用化学指示条进行日常灭菌观察，同时定期使用生物指示剂进行挑战实验，在药典中对各生物指示剂孢子的活孢子数及D值有相关规定，如2010中国药典常用的气体灭菌使用的生物指示剂如下：

A、 环氧乙烷：枯草芽孢杆菌孢子

B、 气态过氧化氢：嗜热脂肪芽孢杆菌孢子

2、 辐射杀菌法：

使用化学指示并对剂量进行监测，同时定期使用生物指示剂进行挑战实验，最常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子，在药典中对其或孢子数、放射剂量及D值有相关规定。但应注意灭菌物品中所负载的微生物可能比短小芽孢杆菌孢子显示更强的抗辐射力，因此短小芽孢杆菌孢子可用于监控灭菌过程，但不能用于灭菌辐射剂量建立的依据。

3、 热力杀菌法

使用化学指示条进行日常灭菌观察，同时定期使用生物指示剂进行挑战实验，在药典中对其或孢子数、D值或单位有相关规定

1） 湿热灭菌法：嗜热脂肪芽孢杆菌孢子，也可使用生孢梭菌孢子。

2） 干热灭菌法：枯草芽孢杆菌孢子，去热原工艺验证时使用大肠埃希菌内毒素。